Iżolament Iggwidat mill-Attività Ta 'Kompożizzjonijiet Fenoliċi Minn Anneslea Fragrans Wall. U l-Effett Ċitoprotettiv Tagħhom Kontra Stress Ossidattiv Indott mill-Perossidu tal-Idroġenu fiċ-Ċelloli HepG2 Parti 1

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Astratt: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05), filwaqt li 6 wera l-aħjar attività kontra l-apoptożi. Ir-riżultati jissuġġerixxu li A.fragrans jista 'jservi bħala sors fitokimiku antiossidant siewi għall-iżvilupp ta' ikel funzjonali u prodotti nutraċewtiċi tas-saħħa.

Kliem ewlieni:Anneslea fragrans; antiossidant; iżolament ggwidat; stress ossidattiv; glikożidi flavonojdi

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

1. Introduzzjoni

Speċijiet ta 'ossiġnu reattiv (ROS) huma prodotti bħala prodotti sekondarji permezz ta' respirazzjoni ossidattiva fi proċessi fiżjoloġiċi u bijokimiċi normali [1]. Bħala radikali ħielsa endoġeni, ROS għandu rwol importanti fis-sinjalar taċ-ċelluli u ż-żamma tal-kostanza tal-ġisem f'medda normali [2]. Jekk ir-ROS ma setgħetx tiġi mnaddfa b'mod effettiv, ROS eċċessiv jista 'jwassal għall-okkorrenza ta' stress ossidattiv, li jista 'jinfluwenza l-proliferazzjoni taċ-ċelluli u l-apoptożi [3]. L-istress ossidattiv huwa relatat mill-qrib ma 'varjetà ta' mard inkluż id-dijabete, l-iperlipemja, l-obeżità, il-kanċer, u mard kardjovaskulari u newrodeġenerattiv [4]. Riċentement, ħafna studji wrew li dieta arrikkita bl-antiossidanti tippossjedi sensiela ta 'effetti ta' benefiċċju minħabba l-kapaċità tagħhom ta 'tkessiħ fuq ROS eċċessiv [5,6].

L-antiossidanti naturali fihom varjetà ta’ molekuli bħal polifenoli[], karotenojdi [8], vitamini [9], komposti li fihom in-nitroġenu [10], u kumarini [9]. Il-polifenoli huma mqassma b'mod wiesa 'madwar ir-renju tal-pjanti u jippromwovu benefiċċji għas-saħħa minħabba l-proprjetajiet antiossidanti tagħhom [11]. Ħafna minnhom, bħal resveratrol u xi derivattivi [12], anthocyanidins [13, isoflavones [14l, catechin [15l, u quercetin [16] huma magħrufa sew għall-effett protettiv tagħhom billi jeliminaw ROS [1]. Għal dawn l-aħħar ftit snin, il-polifenoli ilhom jiġbdu l-attenzjoni fil-prevenzjoni tal-kanċer[17], disfunzjoni kardjovaskulari[18], mard newrodeġenerattiv [19], u tixjiħ [20]. Għalhekk, it-tfittxija għal antiossidanti effettivi hija ħtieġa urġenti biex tiġi promossa s-saħħa tal-bniedem.

Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità

Anneslea fragrans Ħajt. hija pjanta Evergreen, li hija distribwita prinċipalment fin-nofsinhar taċ-Ċina [21]. Minbarra l-iskop ornamentali tiegħu, il-weraq ta 'A.fragrans jintużaw ukoll bħala mediċina folkloristika biex jikkuraw id-deni, il-protezzjoni tal-fwied, it-tisħiħ tal-istonku u l-imsaren Ċina u Kambodja [22], li kienu ġew irreġistrati f'"Yunnan Simao Chinese Herbal Medicine" .Barra minn hekk, il-weraq ġew ipproċessati wkoll bħala xarba tat-te, li hija magħrufa bħala "Pangpo Tea". F'rapporti preċedenti [23], l-estratt ta 'A.fragrans wera attivitajiet antiossidanti u kontra l-malarja. Madankollu, sal-lum, il-komposti fenoliċi antiossidanti tiegħu minn A. fwejjaħ ma ġewx irrappurtati.

Għalhekk, l-iskop ta 'din ir-riċerka kien li tiżola u tidentifika l-komposti antiossidanti mill-weraq ta' A. fragrans li huma responsabbli għall-użu tradizzjonali tagħhom għat-trattament ta 'mard tal-fwied. L-erba' frazzjonijiet, il-frazzjoni tad-diklorometan (DF), il-frazzjoni tal-aċetat tal-etil (EAF), il-frazzjoni tal-n-butanol (BF), u l-frazzjoni tal-ilma residwu (RWF) tal-estratt akweju tal-etanol ġew ivvalutati għall-kontenut totali tagħhom ta' fenoliċi (TPC) u flavonojdi totali. (TFC) u għall-kapaċità antiossidant tagħhom. Il-frazzjoni n-butanol (BF) kellha l-ogħla TPC u TFC bl-aktar attività antiossidanti b'saħħitha. Il-frazzjonament bijo-iggwidat tal-BF ippermetta l-purifikazzjoni tal-komposti. Barra minn hekk, l-effett ċitoprotettiv tal-komposti iżolati twettaq fuq stress ossidattiv indott mill-perossidu tal-idroġenu (H, O,) fiċ-ċelloli HepG2 tal-kanċer tal-fwied uman. Il-produzzjoni ta 'ROS intraċellulari u l-apoptosi taċ-ċelluli ġew determinati bl-użu ta' ċitometrija tal-fluss. Għalhekk, din ir-riċerka tat ingredjent fitokimiku antiossidant siewi għall-iżvilupp u l-użu ta 'weraq A.fragrans bħala suppliment funzjonali (tè b'saħħtu) fl-industrija tal-ikel u s-saħħa.

2. Riżultati u Diskussjoni

2.1.Effiċjenza ta 'Rendiment ta' Frazzjonijiet u Subfrazzjonijiet

Il-qsim likwidu-likwidu minn solventi organiċi u frazzjonament tal-kolonna huma tekniki importanti għall-arrikkiment tal-komposti bijoattivi minn estratt mhux raffinat [24]. Bl-użu ta 'qsim likwidu-likwidu, estratt ta' etanol (CE) minn weraq ta 'A. fragrans ġie suċċessivament frazzjonat b'dichloromethane, aċetat etiliku u n-butanol biex jagħti erba' frazzjonijiet (DF, EAF, BF, u RWF), rispettivament. Il-perċentwali tar-rendiment tal-frazzjonijiet instabu li jvarjaw minn 11 sa 27 fil-mija. Il-frazzjoni tal-ilma residwu (RWF, 27 fil-mija) kellha l-ogħla rendiment, u r-rendimenti ta 'frazzjonijiet oħra kienu fl-ordni kif ġej: frazzjoni n-butanol (BF, 24 fil-mija), frazzjoni tal-aċetat tal-etil (EAF, 21 fil-mija), dichloromethane frazzjoni (DF, 11 fil-mija).

Il-perċentwal tar-rendiment tas-subfrazzjonijiet (BF-A sa E) instab li jvarja minn 3.82 sa 48.4 fil-mija. Il-BF-E ippreżenta l-ogħla rendiment ta '48.4 fil-mija segwit minn BF-D (24.96 fil-mija), li għandu rendiment ogħla b'mod sinifikanti mill-frazzjonijiet l-oħra.

2.2.Analiżi HPLC

Intwera li d-detezzjoni ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC) hija teknika qawwija għad-determinazzjoni kwantitattiva. L-analiżi tal-HPLC wriet li BF kellu l-aktar komposti bl-aktar attività antiossidanti b'saħħitha. Taħt il-gwida ta 'assaġġi antiossidanti u analiżi HPLC, il-frazzjoni antiossidativa ġiet kromatografata aktar għall-iżolament tas-subfrazzjonijiet. Il-BF kien soġġett għal kolonna D101 tar-reżina idratata biex tagħti ħames subfrazzjonijiet (BF-A sa E). L-analiżi HPLC wriet li BF-Cto E kellu l-aktar komposti antiossidanti. Il-frazzjonament bijo-iggwidat ta 'dawn il-frazzjonijiet (BF-C sa E) ippermetta l-purifikazzjoni ta' seba 'komposti puri.

Kif muri fil-Figura 1, il-BF u seba 'komposti puri ġew profilati b'analiżi HPLC. Ibbażat fuq tqabbil mal-ħinijiet ta 'żamma u l-kurvi ta' assorbiment UV, dawn is-seba 'komposti ġew ikkonfermati permezz ta' ħinijiet ta 'żamma f'7.51 min (korrużiv, 7), 7.92 min ((epi) -catechin, 6), 9.38 min (confusoside, 1), 9.57 min((S)-naringenin-7-O{- -D-glucopyranoside, 4), 10.32 min(vaccinii folin, 2), 12.64 min (2',3,4,4'-tetrahydroxydi dihydrochalcone, 5), u 13.95 min (1-[4-( -D-glukopiranosilossi)-2-idrossifenil]-3-(4-idrossi-3-metossifenil) -1-propanone,3)(Figura 1A). Fost dawn, il-komposti 1-6 jappartjenu għal flavonoids, u l-kompost 7 huwa benzoquinolethanoid.

2.3.Kontenut Fenoliku Totali (TPC) u Kontenut Totali ta' Flavonojdi (TFC)

Il-weraq A.fragrans huma tradizzjonalment użati bħala tè tas-saħħa pproċessat u ġew ippruvati li huma riżors tajjeb ta 'fenoliċi u flavonoids [25]. Skont analiżi spettrofotometriċi, it-TPC u TFC ġew ittestjati fi frazzjonijiet u subfrazzjonijiet differenti minn weraq ta 'A. fragrans. Kif muri fit-Tabella 1, il-BF kellu l-ogħla valur TPC b'238.12±12.05 mg GAE/g estratt segwit minn EAF. Id-DF wera l-inqas valur TPC bħala estratt ta '66.52±0.57 mg GAE/g. Bl-istess mod, l-ogħla konċentrazzjonijiet ta 'TFC instabu wkoll f'BF b'valur TFC ta' 165.19±5.21mg RE/estratt. Fir-rigward tal-RWF u l-EAF (66.92±1.38 u 116.12±2.89mg GAE/estratt, rispettivament), kellhom ukoll konċentrazzjonijiet TFC aktar baxxi mill-BF (165.19±5.21 mg RE/g estratt), filwaqt li DF kellu l-inqas konċentrazzjoni TFC bħala 47.94±2.84 mg RE/g estratt. Il-kontenuti ta' TPC u TFCin BF kienu madwar erba' darbiet ogħla minn dawk f'DF.

Id-dejta murija l-preżenza tal-ogħla TPC u TFC f'BF-E b'valuri bħala estratt ta '262.03±1.72mg GAE/g; 180.52± 6.30 mg RE/g estratt, rispettivament, segwit minn BF-D(219.84±4.01 u 157.01±2.50 mg RE/g estratt, rispettivament), BF-C (210.69±6.31 u 151.01±4.33 mg RE/g estratt, estratt rispettivament), filwaqt li BF-B u BF-A kellhom l-inqas valuri TPC u TFC (Tabella 1).

2.4.Attività Antiossidanti

Ħafna mill-polifenoli, speċjalment flavonoids u aċidi fenoliċi, huma sfruttati f'ikel antiossidant popolari (nutraċewtiċi) u jippreżentaw serje ta 'benefiċċji umani [17]. Fl-istudju preċedenti tagħna, il-weraq ta’ A.fragrans ġie ppruvat li huwa riżors tajjeb ta’ polifenoli[26]. Madankollu, l-attività antiossidanti tal-estratt mill-weraq ta 'A. fragrans u l-fitokimiċi tagħha għadhom ma ġewx investigati. Minħabba mekkaniżmi ta 'reazzjoni antiossidativa differenti, tliet analiżi ta' ABTS, DPPH, u FRAP ġew magħquda biex jevalwaw l-attività antiossidant tal-frazzjonijiet u subfrazzjonijiet mill-weraq ta 'A. fragrans.

Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>BF-D. L-attività ta 'tnaqqis fl-assaġġ FRAP wriet li BF-Dhad l-attività antiossidativa l-aktar b'saħħitha, li kienet segwita minn BF-C u BF-E. Ta' min jinnota li tliet subfrazzjonijiet (BF-C sa E) ippreżentaw attività antiossidativa ogħla mill-frazzjoni omm (BF). Meħuda flimkien, BF-C sa E ġiet sottomessa għall-kromatografija tal-kolonna għall-iżolament u l-identifikazzjoni tal-fitokimiċi antiossidanti.

2.5. Attività Antiossidanti tal-Komposti Iżolati

Il-komposti iżolati kollha (komposti 1-7) ġew evalwati għall-kapaċità anti-ossidanti minn ABTS, attività ta ' scavenging radikali DPPH, u attività anti-ossidanti FRAP. Id-dejta kollha hija deskritta fit-Tabella 2. Il-komposti 6 u 2 wrew l-ogħla attività antiossidanti, segwita minn 5. Il-kompost 4 wera attività antiossidant moderata u l-komposti 1, 3, u 7 tqiesu inattivi b'attivitajiet ta' tneħħija radikali ABTS u DPPH inqas minn 200 μmol TE/g estratt. Bl-użu ta 'Vc (l-attivitajiet ta' scavenging radikali b'2932.91 ± 93.63 u 1873.56 ± 121.68 umol TE/g estratt, rispettivament) bħala l-kontroll pożittiv, kompost6 kellu l-attività antiossidant l-aktar b'saħħitha f'assaġġi ta 'scavenging radical ABTS u DPPH b'1580.37.3. Estratt TE/g （p<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

Barra minn hekk, ir-relazzjoni bejn l-istruttura u l-attività antiossidanti tal-flavonoids (1-6) hija diskussa bi gradi varji ta 'effetti inibitorji. Il-Kompon 2 ippreżenta aktar attività anti-tiossidanti mill-komposti 1, 3, u 5, li ssuġġeriet li l-gruppi 3,4-dihydroxy f'dihydrochalcones f'2 jista 'jkollhom rwol kritiku kontra ABTS, attività ta' scavenging radikali DPPH, u antiossidant FRAP attività, u l-parti tal-glukożju sostitwita f'C-4'in 2 jista' jkollha rwol importanti fuq il-kapaċità antiossidant tagħha [4]. Barra minn hekk, il-kompost 6 wera l-ogħla attività antiossidanti meta mqabbel ma 'komposti oħra, li ssuġġeriet li flavan-3-ols (catechin) probabbilment juru attività ta' scavenging radikali aħjar minn dihydrochalcones u flavanones [27]. Fil-qosor, il-komposti 2, 5, u 6 b'attività antiossidant tajba ġew magħżula aktar għal effetti ċitoprotettivi kontra stress ossidattiv mill-H2O2 fl-istudju li jmiss.

2.6. Relazzjoni bejn l-Attività Antiossidanti u l-Kontenut TPC/TFC

Konċentrazzjonijiet tat-TPC u TFC kienu korrelatati ħafna mal-attività antiossidanti mill-valuri ta' FRAP (r{{0}}.982 u 0.977) u ABTS (r{{=0.959 u 0.965), rispettivament. Il-matriċi ta' korrelazzjoni wriet ukoll korrelazzjoni qawwija bejn il-valuri ABTS u FRAP (r =0.992). Barra minn hekk, saret analiżi multivarjata (PCA), li ġiet estratta mid-dejta tat-Tabella 1. Kif muri fil-Figura 2, PCA spjegat 94.44 fil-mija tal-varjazzjoni totali, li fiha PC1 ammontaw għal 84.73 fil-mija tal-varjanza u PC2 ammontaw għal 9.71 fil-mija. L-analiżi FRAP, ABTS, u DPPH b'EAF u RWF huma mqiegħda fil-kwadrant ta 'fuq tal-lemin, u l-konċentrazzjonijiet ta' TPC u TFC b'BF u BF-Cto E jinsabu fil-kwadrant t'isfel tal-lemin fil-punteġġi pożittivi PC1, rispettivament. Sadanittant, id-DF u BF-A sa B b'konċentrazzjonijiet baxxi ta 'TPC u TFC jinsabu tul l-assi tal-punteġġi negattivi PC1. Dawn is-sejbiet urew li l-konċentrazzjonijiet TPC u/jew TFC huma assoċjati mill-qrib mal-kapaċità anti-ossidanti, u aktar ma jkunu kbar il-konċentrazzjonijiet ta 'TPCor TFC fil-frazzjonijiet u subfrazzjonijiet, ogħla l-valuri tal-kapaċità anti-ossidanti tagħhom. Dawn ir-riżultati wrew li l-kontenut għoli ta 'fenoli u flavonoid fi frazzjonijiet u subfrazzjonijiet differenti minn weraq ta' A. fragrans jistgħu jikkontribwixxu għall-attività antiossidanti.

Figura 2. Analiżi PCA fuq fenoliċi totali, flavonoids, u attività antiossidanti. Mezzi b'ittri differenti jindikaw differenzi sinifikanti (p<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

Dan l-artikolu huwa estratt minn Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules