Vaċċin Bivalent tal-Virus tal-Influwenza Attenwat Ħaj Jipproteġi Kontra l-Iżolati Kliniċi H1N2 u H3N2 imġarrba fil-Ħnieżer Parti 1

Astratt:

Il-viruses tal-influwenza A (IAVs) jistgħu jikkawżaw mard respiratorju li jittieħed ħafna għal ħafna speċi mammiferi. Fil-ħnieżer, l-IAVs jikkawżaw mard ta 'morbidità għolja u mortalità baxxa f'popolazzjonijiet suxxettibbli li jista' jkollhom impatti finanzjarji u ta 'produzzjoni sinifikanti. Jistgħu wkoll jippreżentaw opportunitajiet għal mutazzjonijiet u għażla mill-ġdid tal-ġeni, li jipproduċu razez tal-influwenza b'potenzjal pandemiku.

L-influwenza A hija marda respiratorja li tittieħed ħafna li toħloq theddida serja għas-saħħa pubblika globali. Studji relatati mal-immunità wrew li sistema immuni b'saħħitha tista' tagħmel lin-nies aktar kapaċi jiġġieldu l-virus meta jkunu infettati bil-virus tal-influwenza, u b'hekk tnaqqas l-inċidenza u s-severità tal-marda.

L-immunità hija l-abbiltà tas-sistema immuni tagħna biex tiġġieled il-mard. Is-sistema immunitarja tal-bniedem tikkonsisti f'żewġ partijiet: immunità innata u immunità miksuba. Is-sistema immuni intrinsika hija dak li twieldu biha u għandha l-abbiltà tal-ġisem kollu li jiddefendi kontra l-mard. Is-sistema immunitarja miksuba hija l-immunità li għandna gradwalment f'ħajjitna, prinċipalment inkluża immunità umorali komposta minn ċelluli immuni u antikorpi, u immunità ċellulari komposta minn ċelluli T u ċelluli immuni.

Studji wrew li billi żżomm stil ta 'ħajja u dieta b'saħħitha, tagħmel eżerċizzju, u tieħu biżżejjed vitamini u nutrijenti oħra, tista' ttejjeb is-sistema immuni tiegħek. Barra minn hekk, il-vaċċin jista 'wkoll itejjeb l-immunità tal-ġisem għall-viruses tal-influwenza u jnaqqas l-inċidenza tal-mard.

Il-viruses tal-influwenza A huma kondiviżi mill-bnedmin u l-annimali, u għalhekk ħafna drabi jinbidlu. Speċjalment fil-ħarifa u fix-xitwa, l-immunità tan-nies hija baxxa, u l-virus tal-influwenza A jista 'faċilment jattakka billi jieħu vantaġġ minn din l-opportunità. Imma jekk ninsistu li niżviluppaw stil ta 'ħajja b'saħħtu, insaħħu l-eżerċizzju, u ntilqim b'mod attiv, nistgħu ntejbu l-immunità tagħna u nittrattaw aħjar l-invażjoni tal-virus tal-influwenza A. Barra minn hekk, jekk issib li għandek sintomi bħal tal-influwenza, għandek tfittex kura medika u tirċievi trattament fil-ħin, sabiex ġismek ikun jista’ jirkupra malajr.

Fil-qosor, hemm influwenza reċiproka bejn il-virus tal-influwenza A u l-immunità. It-tisħiħ tal-immunità tiegħu, iż-żamma ta’ stil ta’ ħajja u dieta sana, u speċjalment l-aċċettazzjoni tat-tilqim huma kollha miżuri effettivi biex jipprevjenu u jiġġieldu kontra l-virus tal-influwenza A. Ejja nkunu pożittivi u nimxu lejn stil ta' ħajja aktar b'saħħtu f'termini ta' prevenzjoni tal-virus tal-influwenza A! Wieħed jista 'jara li rridu ntejbu l-immunità. Cistanche jista 'jtejjeb b'mod sinifikanti l-immunità, minħabba li l-irmied tal-laħam fih varjetà ta' ingredjenti bijoloġikament attivi, bħal polisakkaridi, żewġ faqqiegħ, Huang Li, eċċ Dawn l-ingredjenti jistgħu jistimulaw diversi sistemi immuni. ċelluli bħal ċelluli, iżidu l-attività immuni tagħhom.

Ikklikkja benefiċċji cistanche tubulosa

Għalhekk, huwa importanti ħafna li tiġi evitata u kkontrollata l-infezzjoni tal-influwenza fil-ħnieżer, u l-mod ewlieni biex isir dan huwa permezz tat-tilqim. Is-sottotipi ta' IAV l-aktar prevalenti fil-ħnieżer madwar id-dinja huma H1N1, H1N2, u H3N2; madankollu, id-diversità ġenetika ta 'dawn il-viruses tista' tvarja ħafna skond ir-reġjun. Preċedentement żviluppajna vaċċin ħaj attenwat bivalenti dipendenti fuq elastase bl-użu ta’ żewġ iżolati Kanadiżi tal-virus tal-influwenza tal-ħnieżer A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] u A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2). ) [SD69], li pproteġiet kontra razez omoloġi.

F'dan l-istudju, aħna nuru li dan il-vaċċin jestendi l-protezzjoni fil-ħnieżer għal razez H1N2 u H3N2 mhux omoloġi, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] u A/Swine/AB/SD0435/. 2019 (H3N2) [SD435].

Il-vaċċin wassal għal rispons immuni robust fis-serum u fil-pulmun u naqqas ir-replikazzjoni virali kif ukoll il-patoloġija tal-pulmun assoċjata ma’ dawn ir-razez. Għalhekk, dan il-vaċċin bivalenti jibqa’ kandidat b’saħħtu li jkun ta’ benefiċċju għas-suq tal-vaċċini tal-influwenza tal-ħnieżer fl-Amerika ta’ Fuq.

Kliem ewlieni:

Influwenza; vaċċin; ħnieżer.

1. Introduzzjoni

Il-viruses tal-influwenza A (IAV) huma patoġenu sinifikanti għal ħafna speċi, inklużi l-ħnieżer. L-infezzjoni tista 'tikkawża mard respiratorju li jittieħed ħafna fil-ħnieżer [1]. L-infezzjoni tal-influwenza fil-ħnieżer twassal għal mard ħafif b'mortalità baxxa ħafna, iżda r-rati ta' morbożità f'merħla jistgħu jilħqu 100 fil-mija [2]. Dan jirriżulta f'telf ekonomiku għall-bdiewa minħabba tnaqqis fil-piż fil-ħnieżer infettati tnaqqis fil-prestazzjoni tal-produzzjoni, u falliment riproduttiv fil-majjali nisa [3,4].

Il-ko-infezzjoni tal-influwenza ma' patoġeni respiratorji oħra tal-ħnieżer tista' twassal ukoll għall-iżvilupp ta' kumpless ta' mard respiratorju tal-ħnieżer, u konsegwentement, żieda fil-mortalità u telf ekonomiku [5].
Barra minn hekk, il-ħnieżer huma suxxettibbli għall-infezzjoni bl-IAV tat-tjur u tal-bniedem kif ukoll bl-IAV tal-ħnieżer (swIAV) minħabba l-preżenza ta 'rabtiet ta' galactose tal-aċidu sialiku kemm tat-tjur kif ukoll tal-mammiferi fil-passaġġ respiratorju tagħhom [6]. Dan jagħmilha possibbli li jseħħ riassortiment meta jkun ko-infettat b'diversi razez, li jista 'jwassal għall-produzzjoni ta' razez ġodda b'potenzjal pandemiku [4,7].

Peress li l-bnedmin għandhom distribuzzjoni simili ta' rabta tal-galattożju ta' l-aċidu sialiku tul il-passaġġ respiratorju, avvenimenti ta' tixrid bi-direzzjonali huma possibbli bejn il-bnedmin u l-ħnieżer. L-ewwel okkorrenza magħrufa ta' dan kienet matul il-pandemija tal-influwenza tal-1918 meta l-IAV ġie introdott għall-ħnieżer mill-bnedmin [8]. Dan in-nisel baqa 'stabbli fil-popolazzjonijiet tal-ħnieżer sad-disgħinijiet, meta razez H3N2 tal-bniedem u tat-tjur reassortjati man-nisel H1N1 li jiċċirkola biex jipproduċu razez riassortanti doppji u tripli ta' sottotipi H1N1, H1N2, u H3N2 [8,9].

Il-cassette tal-ġene triple reassortant (TRIG) żviluppat ġdid wassal għal perjodu ta 'diversifikazzjoni rapida tal-IAV fil-majjali tal-Amerika ta' Fuq [10]. Dan il-cassette TRIG huwa stabbli ħafna u jiffaċilita s-sostituzzjoni ta 'kombinazzjonijiet differenti ta' HA u NA [5]. Mill-2005, ħafna razez b'dan il-cassette TRIG intern flimkien ma 'ġeni umani HA u NA mifruxa f'merħliet tal-ħnieżer fl-Istati Uniti [9].

L-avveniment ta' tixrid notevoli li jmiss seħħ fl-2009, meta razza H1N1 ta' oriġini tal-ħnieżer (H1N1pdm2009) infirxet għall-bnedmin, li wassal għall-pandemija tal-influwenza tal-2009 [11]. It-trażmissjoni minn bniedem għal majjali (żoonożi inversa) tal-pandemija umana H1N1 IAV (H1pdm) ġiet irreġistrata diversi drabi fil-majjali tal-Amerika ta 'Fuq, li wasslet għall-istabbiliment ta' nisel ġdid u swIAVs riassortanti ġodda [8,10,12].

B'kollox, ġew irreġistrati seba' clades H1 antiġenikament distinti u erba' clades distinti ta' viruses H3 fil-majjali tal-Amerika ta' Fuq [5]. Riċentement, programm ta 'sorveljanza swIAV fl-Asja identifika virus tal-ġenotip 4 (G4) riassortant li jixbhu l-għasafar Ewrasjatiku (EA), b'ġeni interni H1pdm u triple riassortant.

Dan il-virus G4 tkejjel f'10.4 fil-mija tal-ħaddiema tal-ħnieżer ittestjati, u jippreżenta markaturi ta 'potenzjal pandemiku, bil-kapaċità li jittrasmetti lill-bnedmin u antiġeniċità differenti minn virusijiet umani li qed jiċċirkolaw bħalissa [7]. Għalhekk huwa importanti ħafna li tiġi evitata u kkontrollata l-infezzjoni tal-influwenza fil-ħnieżer kemm mill-perspettiva tal-industrija tal-ħnieżer kif ukoll tas-saħħa pubblika, u l-mod ewlieni biex isir dan huwa permezz tat-tilqim [4].

Fl-Istati Uniti, l-aktar tip komuni ta’ vaċċin huwa l-virus kollu inattivat (WIV), iżda vaċċin ta’ RNA vector li jesprimi HA u NS1-vaċċin tal-virus tal-influwenza attenwat ħaj maqtugħ (LAIV) ġie approvat ukoll [4] . Is-sottotipi ta' IAV l-aktar prevalenti fil-ħnieżer madwar id-dinja, inkluża l-Amerika ta' Fuq, huma H1N1, H1N2, u H3N2 [13].

Id-diversità ġenetika ta 'dawn il-viruses tista' tvarja ħafna skont ir-reġjun, madankollu, u hemm differenzi fl-evoluzzjoni ġenetika tas-swIAV fil-Kanada u l-Istati Uniti, partikolarment fil-viruses tas-sottotip H1 [12]. Is-sorveljanza fil-Kanada bejn l-2009 u l-2016 indikat li l-kladi ġenetiċi ta’ H1 li kienu dominanti fl-Istati Uniti, H1g (1A.3.3.3) u H1d-1 (1B.2.2), ma ġewx skoperti fil-Kanada, u l- Il-viruses H1 fil-Kanada kienu diverġenti ħafna minn dawk tal-Istati Uniti [12].

Ġie identifikat clade H1 ġdid (H1a-3) fil-Kanada li beda fil-Manitoba u għadda minn tkabbir mgħaġġel qabel infirex madwar il-pajjiż u fl-Istati Uniti. Fir-rigward tal-viruses H3, sitt nisel H3 kienu dokumentati fil-majjali Amerikani (IV-A sa IV-F), u minn dawn, tlieta nstabu fil-majjali Kanadiżi (IV-B, IV-C, u IV-E) [12] ].

Dan jenfasizza l-importanza tas-sorveljanza reġjonali u l-għarfien tar-razez li jiċċirkolaw biex jiġu infurmati programmi effettivi tal-vaċċini u jindika li vaċċini mfassla bbażati fuq IAV li jiċċirkolaw fil-majjali Amerikani jistgħu ma jipproteġux il-ħnieżer Kanadiżi [12].

Preċedentement, inħoloq vaċċin bivalenti bl-użu ta’ żewġ iżolati Kanadiżi tas-swIAV, A/ Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] u A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), li huma rappreżentanti għall-H{{ 9}} grupp antiġeniku u grupp antiġeniku H3 ġdid mill-Punent tal-Kanada (grupp tal-ħnieżer IV-E), rispettivament [14]. Dan il-vaċċin ġdid huwa vaċċin tal-virus ħaj attenwat magħmul bl-użu ta' forom dipendenti fuq elastase ta' SD191 u SD69, SD191−R342V, u SD69-K345V. Studji wrew li kien protettiv kemm kontra SD191 kif ukoll SD69, kif ukoll razza H1N2 eterologa A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2) li kienet iżolata wkoll mill-Punent tal-Kanada [14].

Minn dakinhar, ir-razez swIAV li jiċċirkolaw komplew jimxu. Iżolati kliniċi aktar riċenti mill-ħnieżer fil-Punent tal-Kanada nġabru u iżolati minn kampjuni fuq il-post fil-Kulleġġ tal-Punent tal-Mediċina Veterinarja, Università ta 'Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] huwa membru tal-grupp antiġeniku H -3 iżda għandu ħames sostituzzjonijiet ta' aċidi amminiċi minn 54 sit antiġeniku ewlieni H1 meta mqabbel ma' SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] huwa membru tal-grupp IV-E iżda marret biex jinkludi żewġ sostituzzjonijiet ta 'aċidi amminiċi mis-sitt siti antiġeniċi ewlenin H3 [17].

F'dan l-istudju, aħna evalwajna jekk il-LAIV bivalenti li tiddependi mill-elastasi kienx iżomm kontra iżolati kliniċi ġodda, u jista 'jirrapporta li jipproteġi l-ħnieżer meta kkontestat b'razez swIAV li qed jiċċirkolaw bħalissa SD467 (H1N2) u SD435 (H3N2).

2. Materjali u Metodi

2.1. Ċelloli u Virus

Iċ-ċelluli tal-kliewi tal-kliewi tal-kliewi Madin-Darby (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) inżammu f'Medju Essenzjali Minimu (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA) li kien fihom 10 fil-mija serum tal-fetu bovin. (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada 16000-044), u nżammu f'inkubatur umidifikat ta' 5 fil-mija CO2 f'37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] u A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV ġew iżolati minn kampjuni fuq il-post fil-Kulleġġ tal-Mediċina Veterinarja tal-Punent, Università ta’ Saskatoon, Saskatoon, , SK, Kanada.

Il-viruses tal-vaċċin SD191−R342V u SD69- K345V ġew salvati kif deskritt qabel [14]. Il-viruses kollha tkabbru f'ċelloli MDCK fil-preżenza ta' 0.2 fil-mija albumina tas-serum bovin (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) jew b'1 µg/mL L-[(toluene{ {11}}sulfonamide)-2-phenyl] ethyl chloromethyl ketone (TPCK)- trypsin (viruses WT) jew 0.5 µg/mL newtrophil elastase umana (viruses dipendenti fuq elastase) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Disinn tal-Prova tal-Annimali

Erbgħa u għoxrin ħnieżer ta 'erba' ġimgħat swIAV negattivi nkisbu mill-Prairie Swine Centre Inc. (Saskatoon, SK, Kanada). Dawn il-ħnieżer ġew magħżula bl-addoċċ u maqsuma f'erba 'gruppi b'seba' ħnieżer għal kull grupp imlaqqam, u ħames ħnieżer għal kull grupp imlaqqam finta.

L-assenjazzjoni tal-grupp hija deskritta fil-Figura 1A. Dawn il-gruppi kienu miżmuma fi kmamar separati bbażati fuq gruppi ta’ tilqim (gruppi A flimkien B u C u D miżmuma flimkien) u tħallew jakklimatizzaw għal sebat ijiem qabel l-infezzjoni.

Fl-età ta' ħames ġimgħat (jum 0) kif ukoll fl-età ta' tmien ġimgħat (jum 21), il-ħnieżer fil-gruppi A u B ġew imlaqqma mock intratrakeally b'4 mL ta' MEM, filwaqt li l-gruppi Ċ u D ġew imlaqqma. b'vaċċin bivalenti li jkun fih 1 × 106 PFU ta' kull SD191−R342V u SD69-K345V f'4 mL MEM. Għaxart ijiem wara (jum 31), il-ħnieżer ġew ikkontestati jew b'MEM (mock) jew 1 × 106 PFU ta' jew SD435-WT (H3N2) jew SD467-WT (H1N2).

Il-ħnieżer ġew immonitorjati għal ħamest ijiem wara l-isfida, b'temperaturi rettali meħuda kuljum u tampuni nażali meħuda miż-żewġ imnifsejn fil-jiem 1, 3, u 5. Is-serum inġabar wara l-ewwel (jum 20) u t-tieni (jum 30) tilqim għal l-assaġġ tan-newtralizzazzjoni tal-virus tas-serum (SVN) u l-assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi (ELISA).

Fil-jum 5 wara l-isfida, il-ħnieżer kollha ġew ewtanizzati b'mod uman, u l-pulmuni ġew estratti u evalwati għall-preżenza ta 'leżjonijiet grossi karatteristiċi swIAV. Inġabru wkoll kampjuni tat-tessut tal-pulmun għall-iżolament tal-virus (Figura 1B).

2.3. Dikjarazzjoni ta' Etika

Il-proċeduri kollha tal-annimali ġew approvati mill-Kumitat tal-Kura tal-Annimali tal-Università (UACC) u l-Bord tal-Etika tar-Riċerka tal-Annimali (AREB) tal-Università ta 'Saskatchewan. Dan il-protokoll ġie approvat fit-12 ta’ Novembru 2021 (Protokoll dwar l-Użu tal-Annimali #20190064). Il-proċeduri kollha twettqu skont l-istandards meħtieġa mill-Kunsill Kanadiż tal-Kura tal-Annimali (CCAC) fl-Organizzazzjoni tat-Tilqim u l-Mard Infettiv (VIDO), Università ta 'Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada.

2.4. Teħid ta' kampjuni

Tampuni tal-imnieħer minn kull imnifsejn tqiegħdu f'1 mL ta 'MEM li kien fihom 1 × antimikotiku antibijotiku (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada, 15240-062) u ffriżati f'-80 ◦C sakemm sar qRT-PCR. Il-ħnieżer kollha ġew ewtanizzati b'mod uman permezz ta' għoti ġol-vini ta' etanol (240 mg/mL sodium pentobarbital; 2 mL għal kull 4.5 kg). Mal-ewtanasja, il-pulmuni tneħħew in toto biex jiddeterminaw kemm il-perċentwali ta 'leżjonijiet sodi vjola-aħmar kif ukoll pnewmonja.

Il-perċentwali ġew determinati abbażi tal-piżijiet tal-lobi tal-pulmun kif ukoll il-volum kollu tal-pulmun [18]. Ittieħdu wkoll kampjuni tal-pulmun mil-lobi apikali, kardijaċi u dijaframmatiċi tal-lemin għat-titrazzjoni virali. Dawn il-kampjuni tal-pulmun tħalltu f'volumi ugwali ta '10 fil-mija w/v MEM li fihom 1 × antibijotiku-antimikotiku għat-titrazzjoni.

Figura 1. Il-grupp tal-ħnieżer u d-disinn tal-prova għall-evalwazzjoni tal-effikaċja protettiva tal-LAIV bivalenti kontra iżolati kliniċi ġodda. Ħnieżer (n=5 għal gruppi MEM/MEM u n=7 għal gruppi bivalenti/bivalenti) ġew imlaqqma intratrakealment b'4 mL ta' MEM jew il-vaċċin bivalenti magħmul minn 1 × 106 PFU ta 'kull SD191−R342V u SD69-K345V fil-jiem 0 u 21. Fil-jum 31, il-ħnieżer ġew sfidati intratrakeally b'MEM jew 1 × 106 PFU ta' jew SD435 (H3N2) jew SD467 (H1N2). (A)

L-iskeda tat-tilqim, l-isfida u t-teħid tal-kampjuni għal din il-prova fuq l-annimali. Erbgħa u għoxrin ħnieżer ta 'erba' ġimgħat negattivi għas-swIAV tħallew jakklimatizzaw għal sebat ijiem qabel l-infezzjoni. Fl-età ta' ħames ġimgħat (jum 0) kif ukoll fl-età ta' tmien ġimgħat (jum 21), il-ħnieżer fil-gruppi A u B ġew imlaqqma mock intratrakeally b'4 mL ta' MEM, filwaqt li l-gruppi Ċ u D ġew imlaqqma. b'vaċċin bivalenti li jkun fih 1 × 106 PFU ta' kull SD191−R342V u SD69-K345V f'4 mL MEM.

Għaxart ijiem wara (jum 31), il-ħnieżer ġew ikkontestati jew b'MEM (mock) jew 1 × 106 PFU ta' jew SD435-WT (H3N2) jew SD467-WT (H1N2). Il-ħnieżer ġew immonitorjati għal ħamest ijiem wara l-isfida, b'temperaturi rettali meħuda kuljum u tampuni nażali meħuda miż-żewġ imnifsejn fil-jiem 1, 3, u 5. Is-serum inġabar wara l-ewwel (jum 20) u t-tieni (jum 30) tilqim. Fil-jum 5 wara l-isfida (jum 36) il-ħnieżer kollha ġew ewtanizzati b'mod uman, u l-pulmuni ġew estratti għall-evalwazzjoni. (B) Maħluq ma 'BioRender.com.

2.5. Analiżi Immunosorbenti Marbuta ma' Enżimi (ELISA)

Biex isiru antiġeni tal-kisi, SD435 u SD467 ġew propagati f'ċelloli MDCK u ppurifikati bl-użu ta 'ultraċentrifugazzjoni tal-gradjent ta' sukrożju. L-inattivazzjoni tal-viruses seħħet billi żżid 97 fil-mija -propiolactone mal-virus f'konċentrazzjoni ta '1:1000 (v/v) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Din it-taħlita kienet imbandla f'4 ◦C matul il-lejl, inkubata f'37 ◦C għal sagħtejn biex tiffaċilita l-idrolisi ta '-propiolactone, imbagħad maħżuna f'-80 ◦C sakemm tintuża.

Biex jitkejlu l-livelli ta’ IgG speċifiċi għal swIAV indotti mit-tilqim u l-isfida, is-serum tal-majjal ittieħed wara l-ewwel (jum 20) u t-tieni (jum 30) tilqim, u qabel in-nekropsja (jum 36).

Virusijiet purifikati inattivati ​​bil-propiolactone SD435 (1 µg/mL), u SD467 (2 µg/mL), dilwiti f'buffer tal-kisi tal-karbonat/bikarbonat, (pH 9.6) ġew applikati għal pjanċi Immulon-2 96-bir 1{{ 12}}0 µL/bir (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Kanada, 3655) u inkubat matul il-lejl f'4 ◦C. Wara l-inkubazzjoni matul il-lejl, il-pjanċi miksija ġew maħsula erba 'darbiet bit-TBST (0.1 M Tris, 0.17 M NaCl, u 0.05 fil-mija Tween 20), li magħhom ġew miżjuda dilwizzjonijiet serjali ta' erba 'darbiet tas-serum jew BALF ma' il-pjanċa f'żewġ kopji, segwit minn inkubazzjoni ta' sagħtejn f'temperatura tal-kamra. Serum ġie miżjud f'dilwizzjoni tal-bidu ta '1:10, u BALF ġie miżjud mhux dilwit.

Kampjuni ta' serum ta' kontroll pożittiv definiti qabel u l-kontrolli negattivi xierqa, serum, u BALF minn ħnieżer mhux imlaqqma fi studju preċedenti tħaddmu fuq kull pjanċa [14]. Il-pjanċi ġew maħsula erba 'darbiet b'TBST, wara li mogħoż anti-ħnieżer IgG (H plus L) phosphatase-tikkettjati affinità purifikata antikorp (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) jew ġurdien kontra l-majjal IgA (Serotec, MCA658) ( 1:300) dilwit f'TBST ġie miżjud u jitħalla jinkuba f'temperatura tal-kamra għal siegħa.

L-ELISAs IgA ġew żviluppati biż-żieda ta’ antikorpi IgG (H plus L) tal-mogħoż bijotinilati kontra l-ġurdien (CALTAG, Burlingame, CA, USA, M30015) u soluzzjoni ta’ fosfatażi alkalina ta’ streptavidin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) it-tnejn għal siegħa f'temperatura ambjentali. Wara l-inkubazzjoni, iż-żewġ pjanċi IgG u IgA ġew maħsula erba 'darbiet b'TBST, li għaliha p-nitrophenyl phosphate substrate (PNPP) [10 mg/mL p-nitrophenyl phosphate di(tris) melħ kristallin (Sigma-Aldrich), 1 fil-mija dietanolamina ( Sigma-Aldrich), 0.5 mg/mL MgCl2, u pH 9.8] (1 mg/mL) ġiet miżjuda u inkubata f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn.

Ir-reazzjoni twaqqfet permezz taż-żieda ta '0.3 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), u l-pjanċi jinqraw fi spettrofotometru f'405 nm b'referenza ta' 490 nm. It-titer tal-kampjun kien definit bħala l-ogħla dilwizzjoni li fiha l-OD ta’ dak il-kampjun kien ogħla mill-limitu definit (l-OD medju ta’ kampjun negattiv magħruf flimkien mad-doppju tad-devjazzjoni standard).

2.6. Assaġġ tan-Newtralizzazzjoni tal-Virus (VN).

Iċ-ċelloli MDCK (3.5 × 104 ) ġew ibbanjati fi 96-pjanċi tal-bir. Serum u BALF ġew inattivati ​​bis-sħana f'56 ◦C għal 30 min. Dilwizzjonijiet doppji tas-serum u BALF ġew miżjuda mal-pjanċa f'kwadruplikati, u 60 µL ta 'serum dilwit jew BALF ġew inkubati b'volum ugwali ta' SD435 jew SD456 li kien fih 100 TCID50 f'37 ◦C għal siegħa.

Imbagħad ġie miżjud 100 µL tat-taħlita maċ-ċelloli MDCK, u l-effett ċitopatoġeniku (CPE) ġie dokumentat fi 48 siegħa u 72 siegħa wara l-infezzjoni (pi). It-titru tal-antikorpi tan-newtralizzazzjoni kien l-ogħla dilwizzjoni ta' kull kampjun tas-serum li pproteġiet kompletament iċ-ċelluli minn CPE f'mill-inqas 2 minn 4 bjar.

2.7. Determinazzjoni Viral

Mal-ġbir, il-kampjuni tal-pulmun tqiegħdu immedjatament fuq is-silġ u ffriżati f'-80 ◦C sal-ipproċessar. Għall-ipproċessar, kull tessut tal-pulmun ġie miżun u konċentrazzjoni ta '10 fil-mija (w/v) ta' MEM supplimentata b'1 × antibijotiku-antimikotiku (Thermo Fisher Scientific, 15240-062) ġiet miżjuda. It-tessut tal-pulmun ġie omoġenizzat fit-TissueLyser II (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja) f'30 Hz għal 5 min, segwit minn ċentrifugazzjoni f'5000 × g għal 10 min f'4 ◦C. Is-supernatant omoġenizzat inġabar u maħżun f'-80 ◦C sa aktar analiżi.

It-tampuni nażali ġew vortexed għal 15-il sekonda u ċentrifugati f'1600 × g għal 25 min f'4 ◦C. Is-supernatanti ġew miġbura u maħżuna f'-80 ◦C sa aktar analiżi. It-titri virali ġew determinati b'assaġġ TCID50 għall-pulmun u RT-PCR kwantitattiv għat-tampuni tal-imnieħer.

2.8. Estrazzjoni ta' RNA u RT-PCR kwantitattiv (qRT-PCR)
Biex jiġu ddeterminati l-livelli ta 'RNA virali ta' SD467 u SD435 fit-tampuni nażali wara l-isfida, sar qRT-PCR. Saret kurva standard bl-użu ta 'RNA estratt minn SD435 u SD467 ta' titer magħruf. Fil-qosor, ir-RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Toronto, ON, Kanada, 74136) intuża biex jiġi estratt vRNA minn 200 µL ta 'ħasil tal-imnieħer.

L-RNA ġie kkonvertit għal cDNA bl-użu tal-primer universali tal-influwenza Uni12 u SuperScript III Transcriptase (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) [19]. qPCR twettqet fi tliet kopji fuq sistema StepOnePlusTM Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) bil-Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µL cDNA, u 1 µL ta’ 10µM primers quddiem u reverse. Ir-reazzjonijiet tal-PCR tmexxew f'temperatura ta 'ttemprar ta' 58 ◦C għal 40 ċiklu. Is-sekwenzi kollha tal-qPCR primers huma disponibbli fuq talba.

2.9. Analiżi Statistika

Analiżi statistika saret bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 8. Intużaw it-testijiet mhux parametriċi Mann-Whitney u Kruskal-Wallis. Differenzi sinifikanti huma indikati b'* (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0.001) , jew **** (p < 0.0001). ns=mhux sinifikanti.

For more information:1950477648nn@gmail.com